|
Chemicky modifikované elektródy ako chemické senzory a biosenzory
The detection of smaller and smaller amounts of often-new compounds in more and more complex matrix of the analysed sample belongs to the tasks of chemical analysis today. To fulfil this goal, more and more powerful equipment is necessary, which allow efficient separation and sensitive or even selective detection of individual components of the mixture. The use of simple devices (laboratory as well as pocket apparatus) in combination with sensitive and selective chemical sensors and biosensors represents an alternative approach to the solution of individual tasks, particularly in small labs or in field.
K súčasným úlohám chemickej analýzy patrí detekcia stále menšieho množstva neraz nových látok v stále zložitejšej matrici analyzovanej vzorky. Splnenie tohto cieľa vyžaduje neustále náročnejšiu experimentálnu techniku umožňujúcu veľmi účinnú separáciu a citlivú, popr. aj selektívnu detekciu jednotlivých zložiek zmesi. Alternatívnym postupom pri riešení konkrétnych úloh, najmä v malých technologických či zdravotníckych laboratóriách alebo pri analytickej kontrole v teréne, je využitie jednoduchých meracích zariadení (laboratórnych prístrojov aj vreckových meračov) v kombinácii s citlivými a selektívnymi chemickými senzormi a biosenzormi.
1. Chemické senzory
Chemický senzor spravidla pozostáva z diskriminátora ako zložky schopnej molekulového rozlíšenia sledovanej látky (analytu) a z prenášača signálu, ktorý spracováva primárny analytický signál diskriminátora do merateľnej formy. Chemické či biochemické rozlíšenie analytu umožňujú komplexotvorné alebo iné väzbové látky (napr. pri stanovení iónov kovov a špeciácie chemických foriem kovov vo vodách či telových tekutinách), katalyzátory a enzýmy (pri stanovení glukózy a mnohých ďalších substrátov), imunochemické protilátky (pri detekcii toxických látok v úlohe antigénov), kyselina deoxyribonukleová (DNA), oligosacharidy, proteíny, neuroreceptory a ďalšie. Prenášače signálu podľa funkčného princípu môžu byť elektrické alebo elektrochemické (zahrňujúce potenciometrické, ampérmetrické, tranzistorové a vodivostné), ďalej optické (vrátane svetlovodičov), piezoelektrické, termické a iné.
2. Chemicky modifikované elektródy
Chemicky modifikované elektródy (CME) predstavujú z konštrukčného hľadiska obvyklé voltampérometrické elektródy a mikroelektródy z ortuti, rôznych foriem uhlíka, uhlíkovej pasty alebo inertného kovu, ktorých povrch či objemová fáza sú cielene upravené tenkou vrstvou (do 100 nm) alebo kompozitnou prímesou chemického modifikátora dovoľujúceho selektívne postihnúť analyt. Racionálnou chemickou úpravou tak môže elektróda získať chemické, elektrochemické, elektrické, optické, transportné alebo iné požadované vlastnosti [1]. CME sa vo vedeckom výskume objavujú asi od 70. rokov a v elektroanalytickej chémii od 80. rokov dvadsiateho storočia. Svoje uplatnenie našli tiež v ďalších oblastiach techniky, ako je elektronika na molekulovom princípe, elektrochromizmus, fotoaktívne elektródy, ochrana proti korózii, elektrokatalýza, elektrosyntéza i biomedicínske inžinierstvo. Odozva takejto elektródy potom zohľadňuje dve samostatné zložky: zvyčajnú elektrochemickú, riadenú napr. polarizačným potenciálom, a špeciálnu chemickú, danú reaktivitou viazaného chemického modifikátora.
3. Príprava a využitie CME
Chemický modifikátor sa viaže na konvenčnej elektróde adsorpciou, zachytením v polymérnom filme alebo chemickou väzbou, čo ovplyvňuje jeho (bio)chemickú reaktivitu, ako aj skladovaciu a najmä funkčnú stabilitu výsledného senzora. K populárnym formám CME, najmä v podmienkach malých laboratórií a prenosných voltampérometrických analyzátorov, začínajú patriť jednorázovo použiteľné trojelektródové súbory. Tie sa skladajú z chemicky modifikovanej indikačnej, potenciálovej referenčnej a pomocnej prúdovej elektródy (obr. 1) a pripravujú sa na báze uhlíkovej pasty, popr. zlatého filmu, technikou sieťotlače (screen-printing).
Na modifikáciu povrchu elektródy sa často využívajú komplexotvorné alebo ionovýmenné látky a redoxné mediátory vo forme komplexných zlúčenín kovov. Komplexotvorné a iónovýmenné modifikátory rozšírili spektrum elektrochemicky stanoviteľných iónov kovov a umožnili stanovenie chemickej špeciácie kovov a s ňou súvisiacej biologickej aktivity či toxicity kovov. Chemickou akumuláciou analytu vo vrstve modifikátora sa všeobecne dosiahla nielen vysoká selektivita senzora voči sledovanej látke, ale aj vysoká citlivosť, bežne umožňujúca stanovenie koncentrácií na úrovni 10–7 až 10–10 mol/l. Práve princíp CME dovoľuje obmenou chemického modifikátora získať viacero konštrukčne podobných senzorov s rôznym koncentračným detekčným oknom pre daný analyt, a tým stanoviť tento analyt, resp. jeho chemické formy (špeciáciu), vo vzorkách rôzneho zloženia [2].
Redoxné mediátory zase dovolili stanovenie látok so zlým elektrochemickým chovaním na holej nemodifikovanej elektróde, napr. elektrokatalytické stanovenie rozpusteného kyslíka, peroxidu vodíka, glukózy, aminokyselín, vitamínov, NADH atd. Pri analýze vzoriek zložitej matrice, ako sú odpadové vody či telové tekutiny, sa využíva pokrytie elektródy semipermeabilnou membránou separujúcou častice podľa veľkosti, tvaru alebo náboja, ako aj možnosť kombinácie diskriminátorov tak, aby bol povrch senzora chránený pred rušivým vplyvom interferentov. Napríklad polymérna membrána nafionu so sulfoskupinami nesúcimi záporný náboj účinne separuje negatívne nabité vysokomolekulové zložky vzorky, pritom stabilizuje modifikátory ako ortuťový film alebo enzýmovú vrstvu. Viaceré chemické modifikátory na báze polymérnych filmov vykazujú tiež významné elektrovodivé a elektrokatalytické vlastnosti a podľa spôsobu prípravy môžu zabezpečiť aj sterilnosť senzora pre použitie in vivo a ďalšie vlastnosti [2].
4. Elektrochemické biosenzory
K snáď najznámejším biosenzorom vôbec patria enzýmové elektródy [3]. Za štyridsať rokov od konštrukcie senzora s glukozooxidázou v makroskopickej membráne na platinovej katóde Clarkovej kyslíkovej elektródy sa vývoj uberal smerom k modifikácii povrchu či objemu indikačnej elektródy ako čistými enzýmami tak aj biologickými materiálmi (tkanivami banánu, uhorky, zemiaku a i.) obsahujúcimi enzýmy. Pri nižšej cene biosenzora sa tak získa vyššia stabilita biozložky existujúcej v prirodzenom mikroprostredí, avšak tiež nižšia selektivita stanovenia s ohľadom na polyenzymatický charakter biologického materiálu.
Prudký vývoj postihol tiež využívanie redoxných mediátorov, zabezpečujúcich prenos náboja od aktívneho centra enzýmu k elektróde namiesto prirodzeného mediátora, akým je kyslík. Odhaduje sa, že asi 80 % navrhnutých riešení sa týka klinicky významného stanovenia glukózy. Zvlášť veľký pokrok sa zaznamenal v príprave senzorov s dehydrogenázami a redoxnými mediátormi NADH.
Naša aktivita sa v ostatných rokoch zameriava na elektrochemické biosenzory, kde diskriminátorom je DNA alebo cyklodextrín. DNA na seba púta veľkú pozornosť najmä v súvislosti s riešením genetických otázok, procesov starnutia a onkologických ochorení. Istou zvláštnosťou biosenzorov na báze DNA v porovnaní s inými biosenzormi sa javí dôraz práve na sledovanie reaktivity samotnej DNA a snáď až v druhom rade jej využitie pre analytickú detekciu iných látok. DNA biosenzory, menovite na báze uhlíkovej elektródy, možno úspešne využiť v klinickej, environmentálnej, potravinárskej aj kriminalistickej analýze pri stanovení sekvencie báz DNA, ktoré je založené na hybridizácii (párovaní) báz jednovláknovej ssDNA vo funkcii biochemického diskriminátora s hľadanou sekvenciou ssDNA ako analytu. Priebeh hybridizácie umožňujú sledovať rôzne redoxne aktívne markery dvojvláknovej dsDNA [4].
Obr. 2. Diferenčný pulzový voltampérogram guanínu získaný na DNA modifikovanej SPE porovnaný so záznamom na nemodifikovanej SPE. Podmienky: 0,50mol/l octanový tlmivý roztok pH 4,80 s 0,020mol/l NaCl, amplitúda pulzu 100 mV, scan 25 mV/s
V centre pozornosti sú tiež väzbové interakcie DNA, popr. cyklodextrínu [5], [6], s nízkomolekulovými látkami, ako sú liečivá, polutanty a rizikové chemikálie. Pomocou dsDNA-modifikovaných elektród sa vyšetril typ a stabilita väzby, popr. miera zmeny štruktúry DNA, pri pôsobení rôznych liečiv, lokálnych anestetík, derivátov polycyklických aromatických uhľovodíkov ako primárnych polutantov alebo ich metabolitov, anorganických rizikových látok, agrochemikálií a iných látok. Akumulácia sledovaných analytov vo vrstve DNA sa využila na stopové stanovenie látok aj na sledovanie ich enzymatickej degradácie v sére.
Vlastné meranie je pritom založené na elektrochemickom signálu sledovanej látky (analytu), guanínu samotnej DNA (obr. 2) alebo elektroaktívneho markera DNA, väzbovo súťažiaceho s eletrochemicky neaktívnym nízkomolekulovým analytom (obr. 3).
Obr. 3. Diferenčný pulzový voltampérogram redoxného markera dsDNA [Co(phen)3]3+ získaný na DNA modifikovanej SPE porovnaný so záznamom v roztoku bez markera. Podmienky: 120s akumulácia markera z 5 × 10–7 mol/l roztoku v 0,005mol/l fosforečnanovom tlmivom roztoku pH 7,05, amplitúda pulzu 100 mV, scan 25 mV/s
Nemenej významnou úlohou v oblasti výskumu DNA je detekcia štruktúrneho poškodenia až hlbokej degradácie DNA, zahrňujúcej štiepenie reťazca DNA účinkom vysokoreaktívnych radikálov kyslíka, dusíka a síry pri tzv. oxidačnom strese v organizme. Aj tu hrajú DNA-modifikované ortuťové, uhlíkové či zlaté elektródy úlohu efektívnych senzorov. Na jednej strane môžu ako alarmové systémy indikovať prítomnosť DNA štiepiacich látok (prooxidantov) a na druhej strane dokážu detegovať látky s preventívnym účinkom voči oxidačnému poškodeniu (antioxidanty). V prvom prípade signál markera DNA klesá, kým v druhom prípade ostáva blízky hodnote získanej pre pôvodnú DNA. V spolupráci s potravinárskou a chemickou výskumnou základňou sme takto hodnotili najmä polysacharidy a fenolické fytochemikálie (napr. biologicky a medicínsky širokoúčinné flavonoidy vyskytujúce sa v ovocí, zelenine a nápojoch), a to ako čisté štandardy, ako aj v rôznych rastlinných extraktoch a čajoch. Získava sa tak obraz o koncentračných hlad
inách fytochemikálií a iných chemikálií s poškodzujúcim a ochranným účinkom voči DNA in vitro [7]. Výsledky sa overujú porovnávacím štúdiom pomocou nezávislých konvenčných metód [8].
5. Záver
Chemicky modifikované elektródy a mikroelektródy úspešne rozširujú detekčnú schopnosť prístrojovej chemickej analýzy buď ako senzory v konvenčných či prietokových elektrochemických celách, alebo ako elektrochemické detektory v zložitých analyzátoroch pre chromatografiu a kapilárnu elektroforézu. Navrhnuté senzory a analytické pracovné postupy sú poväčšine priamo využiteľné v praxi, nakoľko vychádzajú z jednoduchej úpravy komerčných elektród s využitím kvalitnej a pritom cenovo dostupnej komerčnej meracej techniky.
Sľubnosť ďalšieho rozvoja podčiarkuje najmä možnosť účinného riadenia analytickej selektivity a citlivosti senzora, dôsledkom čoho je vysoká hodnota pomeru analytickej informácie a ceny. Tieto výhody priamo naznačujú perspektívy vývoja a využitia CME najmä v oblasti štúdia chemickej reaktivity povrchovo viazaných látok a biopolymérov vrátane DNA, v stopovej chemickej analýze, v operačnom určení prejavov chemickej reaktivity analytov, ako je špeciácia komplexov kovov a anti-oxidačná, popr. pro-oxidačná aktivita prírodných a syntetických látok, ale tiež pri monitorovaní vybraných analytov v podmienkach in vivo a elektrochemicky riadenom dávkovaní liečiv.
Literatúra:
[1] KUTNER, W. – WANG, J. – L’HER, M. – BUCK, R. P.: Analytical aspects of chemically modified electrodes: classification, critical evaluation and recomendations. Pure Appl. Chem., 1998, Vol. 70, pp. 1301–1318.
[2] LABUDA, J. – VANÍČKOVÁ, M. - BUČKOVÁ, M. – KORGOVÁ, E.: Development in analysis with chemically modified electrodes and biosensors. Chem. Papers, 2000, Vol. 54, pp. 95–103.
[3] HALL, E. A. H.: Biosensors. Open Univ. Press, Buckingham, 1990.
[4] PALEČEK, E. – FOJTA, M.: Detectiong DNA hybridization and damage. Anal. Chem., 2001, Vol. 73, pp. 74A–83A.
[5] FERANCOVÁ, A. – LABUDA, J. – BAREK, J. – ZIMA, J.: Cyclodextriny ako supramolekulové komplexanty v elektroanalytickej chémii: Prehľad z obdobia rokov 1995–2001. Chem. listy, 2002, Vol. 96, pp. 856–862.
[6] FERANCOVÁ, A. – KORGOVÁ, E. - LABUDA, J. – ZIMA, J. – BAREK, J.: Cyclodextrin modified carbon paste based electrodes as sensors for the determination of carcinogenic polycyclic aromatic amines. Electroanalysis, 2002, Vol. 14, pp. 1668–1673.
[7] LABUDA, J. – BUČKOVÁ, M. – HEILEROVÁ, Ľ. – ŠILHÁR, S. – ŠTEPÁNEK, I.: Evaluation of redox properties and anti-/prooxidant effects of selected flavonoids by DNA-based electrochemical biosensor. Anal. Bioanal. Chem., 2003, Vol. 376, pp. 168–173.
[8] HEILEROVÁ, Ľ. – BUČKOVÁ, M. – TARAPČÍK, P. - ŠILHÁR, S. - LABUDA, J.: Comparison of antioxidative activity data for the aqueous extracts of lemon balm (Melissa officinalis L.), oregano (Origanum vulgare L.), thyme (Thymus vulgaris L.) and agrimony (Agrimonia eupatoria L.) obtained by conventional methods and the DNA-based biosensor. Czech. J. Food Chem., 2003, Vol. 21, pp. 78–84.
prof. Ing. Ján Labuda, DrSc.,
katedra analytickej chémie, Fakulta
chemickej a potravinárskej technológie, Slovenská technická univerzita v Bratislave
(jan.labuda@stuba.sk)
Lektoroval: doc. Ing. Radko Volf, CSc.,
ústav analytické chemie, VŠCHT
|