|
Biosenzory
Článek je úvodem do problematiky biosenzorů pro nezasvěcené čtenáře. Jsou uvedeny výhody a nevýhody použití biosenzorů a problematika jejich konstrukce. Podrobněji jsou rozebrány imunosenzory a biosenzory využívající enzymy, mikrobiální buňky a DNA. Závěrem je zmíněno použití biosenzorů v lékařství, při ochraně životního prostředí, v potravinářství a v biotechnologických procesech a výhled do budoucna. Článek je doplněn slovníčkem vybraných pojmů a dalšími čtyřmi vloženými texty věnovanými biologickému materiálu, jeho imobilizaci, detekci biologického signálu a různým principům fungování biosenzorů, představeným na příkladu stanovování koncentrace glukózy.
1. Úvod
Po vložení hesla biosensor do vyhledávače Google obdržel autor článku více než milion nalezených odkazů. S tímto vědomím přináší předložený článek některé základní informace o tomto rozšířeném fenoménu pro nezasvěcené čtenáře.
Laik si pod pojmem biosenzor pravděpodobně představí detekční zařízení s přízviskem „bio„, v poslední době velmi populárním. Někdo si možná vzpomene na film Bílá velryba a na kanárky, kteří svým mlčením informovali o úniku jedovatých látek. Jiný si možná vzpomene na vyšetření moči s použitím indikátorových papírků. Ekologům se pravděpodobně vybaví lišejníky indikující znečištění životního prostředí. Všechny zmíněné organismy i zařízení by asi skutečně bylo možné označit za biosenzory.
Obr. 1. Obecné schéma biosenzoru
Existuje mnoho definic biosenzoru. Pro účely tohoto textu vyjděme z následující: biosenzor je zařízení, které převádí určitý fyzikální nebo chemický signál na jiný signál, lépe měřitelný, jehož rozpoznávací část tvoří biologický materiál 1). Principiální schéma typického biosenzoru je na obr. 1. Za „otce„ biosenzorů je považován americký vědec Leland C. Clark, vynálezce kyslíkové elektrody. Ten v roce 1962 na sympoziu newyorské akademie věd prezentoval „vylepšenou„ kyslíkovou elektrodu, na kterou s použitím dialyzační membrány imobilizoval enzym glukózaoxidázu. Tento enzym katalyzuje oxidaci glukózy kyslíkem za vzniku glukonové kyseliny. Úbytek kyslíku, který byl úměrný koncentraci glukózy, měřil Clark právě kyslíkovou elektrodou. Na podobném principu (ampérometrické měření vzniklého peroxidu vodíku) pracoval i první komerční biosenzor pro stanovení obsahu glukózy v krvi, který v roce 1973 uvedla na trh firma Yellow Springs Instrument Company. A zařízení pro enzymové stanovení obsahu glukózy v krvi jsou nejrozšířenějšími používanými biosenzory i nyní.
2. Výhody a nevýhody použití biosenzorů
Biosenzory nacházejí uplatnění všude tam, kde jejich použití přináší oproti klasickým nebiologickým senzorům určitou výhodu. Tou může být např. selektivita odezvy, rychlost měření (detekce) nebo nízká cena.
Asi největší výhodou biosenzorů je velká selektivita odezvy. Taková, které u abiotických senzorů nelze dosáhnout. Použití protilátky umožňuje např. detekovat konkrétní bílkovinu ve směsi jí podobných bílkovin, aniž by tyto příměsi vyvolávaly falešnou odpověď biosenzoru. Většina enzymů používaných v biosenzorech katalyzuje přeměnu pouze jednoho hlavního substrátu (chemické látky). Pokud je katalyzována i přeměna jiných látek, obvykle jde jen o látky strukturně podobné a rychlost reakce bývá o mnoho řádů nižší. Zmiňovaný Clarkův biosenzor tak reaguje pouze na glukózu a na ostatní přítomné sacharidy nereaguje buď vůbec, nebo jen zanedbatelně. Enzymy také katalyzují přeměnu pouze jednoho z enantiomerů. Clarkův biosenzor je tak schopen detekovat pouze D-glukózu a na L-glukózu vůbec nereaguje.
|
Základní názvosloví |
|
Analyt
Látka, jejíž koncentrace ve vzorku je měřena. |
|
Elektroda
Elektrický vodič určený k elektrickému spojení kovu s kapalinou. Na elektrodě vždy probíhá oxidačně redukční reakce (výměna elektronů). Pro uzavření elektrického obvodu je třeba použít dvě elektrody. |
|
Fluorescence
Vlastnost látky emitovat po ozáření světlem o jisté vlnové délce (tzv. excitační světlo) jiné světlo o delší vlnové délce (tzv. emisní světlo). Každá fluorescenční látka je charakterizována excitační a emisní vlnovou délkou, při které je intenzita fluorescence nejvyšší. Kromě intenzity fluorescence je často měřen také tzv. poločas zhášení fluorescence (fluorescence life-time). |
|
Gen
Sekvence DNA, v níž je zakódována určitá informace, nejčastěji struktura bílkoviny. |
|
Green Fluorescent Protein (GFP)
Bílkovina, původem z mořské luminiscenční medúzy Aequorea victoria, schopná fluorescence – po ozáření světlem o vlnové délce 395 nm emituje zelené světlo o vlnové délce 508 nm. Díky tomu lze přítomnost GFP snadno detekovat s použitím fluorescenčního spektrofotometru. |
|
Chirální látka
Látka, jejíž molekuly nejsou symetrické. Molekula takové látky existuje ve dvou variantách (tzv. enantiomery, označovány jsou jako L- nebo D-, popř. jako R- nebo S-), které jsou si vzájemně zrcadlovými obrazy. Oba enantiomery mají stejné fyzikální i chemické vlastnosti (např. bod tání nebo barvu), liší se pouze odlišným směrem stáčení roviny polarizovatelného světla. Vzhledem k tomu, že většina látek v živých organismech je chirálních, ale upřednostňován je jen jeden enantiomer (např. všechny aminokyseliny jsou L-, konfigurace D- se neuplatňuje), bývá odlišná i biologická aktivita jednotlivých enantiomerů (např. u léčiv bývá účinný jen jeden enantiomer). |
|
Katalyzátor
Látka, která urychluje chemickou reakci, aniž by se sama přeměňovala. |
|
Kovalentní vazba
Chemická vazba, při které vázané atomy společně sdílejí elektrony valenční (vnější) vrstvy. Bývá obvykle velmi pevná. |
|
Luminiscence
Schopnost živých organismů (např. světlušek) emitovat vlastní světlo. Většina bioluminiscenčních organismů emituje světlo díky chemické reakci kyslíku s látkou nazvanou luciferin. Tuto reakci katalyzuje enzym luciferáza a uvolňuje se při ní světlo. |
|
Optické vlákno
Vodič světla složený ze dvou optických materiálů s různým indexem lomu, z nichž jeden z nich tvoří tzv. jádro, druhý tzv. obal. Při vhodné kombinaci materiálů dochází na rozhraní jádra a obalu k totálnímu odrazu světla s velmi malými ztrátami, a vlákno tak může vést světlo na vzdálenost i stovek kilometrů. |
|
pH
Veličina vyjadřující kyselost roztoku. Matematicky jde o záporný dekadický logaritmus koncentrace iontů H+ v roztoku. Neutrální roztoky mají pH = 7, kyselé <7 a zásadité >7. |
|
Pufr
Směs slabé kyseliny a její soli, která má schopnost v určitém rozsahu absorbovat změny pH. |
|
Substrát
Označení pro chemickou látku, která se účastní enzymově katalyzované reakce a je přeměňována na produkt, popř. produkty. |
Selektivita odezvy celých mikrobiálních buněk naopak může (ale nemusí) být poměrně široká. To umožňuje např. jedním typem biosenzoru sledovat znečištění životního prostředí množstvím příbuzných látek. Biosenzor sice nedá přesné informace o konkrétním znečištění, ale poslouží jako rychlý a levný varovný systém. Výhoda celobuněčných biosenzorů je také v tom, že reagují pouze na látku, která je tzv. biologicky dostupná (např. rozpuštěná ve spodní vodě). To má význam např. při odhadu toxicity nebo při hodnocení dostupnosti látek k přirozenému odbourání.
Mezi přednosti biosenzorů patří také velká rychlost odezvy. Podle konstrukce může biosenzor reagovat na podnět téměř ihned (v řádu sekund), nebo za několik hodin. I několikahodinová inkubace ale představuje urychlení, např. v porovnání s pracným odběrem vzorku, jeho úpravou a dopravou k rozboru do analytické laboratoře.
Použití biologického materiálu s sebou ale nese i některé potíže. Enzymy mají svoje optimální podmínky pro katalýzu (pH, teplota apod.), jejichž dodržení je nutné zajistit (např. vhodným pufrem). Použití nevhodných podmínek vede v lepším případě ke snížení aktivity, a tím i zkreslení výsledků, v horším případě až k denaturaci (poškození prostorového uspořádání), které má za následek dočasné narušení funkční schopnosti senzoru, nebo dokonce k jeho zničení. Mnohé látky také způsobují inhibici enzymů, např. těžké kovy nebo nepřeměnitelná analoga přirozených substrátů. Pokud jsou tyto látky přítomny v analyzovaném vzorku, senzor dá falešnou zápornou odpověď.
Velmi podobná je situace při použití celých buněk. Nevhodné podmínky mohou buňkám působit stres, nebo dokonce způsobit jejich smrt. Buňky ve stresu mohou reagovat na analyzovanou látku výrazně jinak než buňky v klidu (silněji i slaběji) a mrtvé buňky nedávají žádný signál. Při použití celých mikrobiálních buněk nastávají kromě problémů s potenciální toxicitou analyzovaného vzorku ještě problémy se zajištěním vhodných životních podmínek. Kromě už zmiňovaných fyzikálních parametrů typu teplota nebo pH je třeba zajistit i výživu buněk, dostatek vody, přiměřenou koncentraci kyslíku a odstraňování metabolických produktů.
Velkým problémem je také sterilizace biosenzorů. Většinu biologického materiálu nelze sterilizovat v autoklávech, což je běžně používaná metoda např. v medicínské praxi. Pokud je senzor založen na celých buňkách, v praxi obvykle neexistuje způsob, jak ho sterilizovat.
3. Konstrukce biosenzorů
Konstrukce biosenzoru vyžaduje imobilizovat biologický materiál vhodnou metodou do pevného materiálu, k němuž bude připojeno detekční a záznamové zařízení. Pro konstrukci může být použit téměř libovolný biologický materiál, od celých mnohobuněčných organismů, přes jejich tkáně a pletiva až po buněčné biomakromolekuly, zejména enzymy a protilátky (viz rámeček Biologický materiál). Použití vhodné imobilizační techniky (viz rámeček Imobilizace biologického materiálu) závisí jak na charakteru biologického materiálu, tak na charakteru detekčního zařízení (např. pro optický senzor je nutné použít průhlednou matrici). Detekční zařízení závisí na povaze signálu produkovaného biologickým materiálem (viz rámeček Signály biologického materiálu a detektory).
|
Biologický materiál |
|
Bílkoviny
Biologické makromolekuly s nejrůznější biologickou funkcí. Jejich základní struktura je tvořena řetězcem složeným z dvaceti druhů aminokyselin. Tento řetězec je uspořádán do vyšší prostorové struktury, která bývá obohacena o další nebílkovinné složky, např. sacharidy nebo ionty kovů. Časté je také spojení několika bílkovinných podjednotek do funkčního celku. |
|
Enzymy
Bílkovinné katalyzátory urychlující biochemické reakce v organismu. Enzymy patří mezi nejúčinnější katalyzátory vůbec, reakce urychlují o mnoho řádů. Velkou výhodou enzymů je jejich vysoká strukturní specifita, tedy schopnost katalyzovat přeměnu pouze jedné látky a ostatní ignorovat. |
|
Mikroorganismy
Pestrá skupina organismů zahrnující jak vývojově primitivnější bakterie, tak vývojově pokročilejší kvasinky a plísně. Každá buňka představuje samostatný nezávislý organismus. Mikroorganismy se velmi rychle rozmnožují, jsou odolnější a přizpůsobivější než buňky vyšších organismů a jsou schopny využívat širokou škálu živin. |
|
Nukleové kyseliny (deoxyribonukleová kyselina – DNA a ribonukleová kyselina – RNA)
Biologické databanky, v nichž je zakódována většina vlastností organismu, mj. struktura všech jeho bílkovin. Genetická informace je vyjádřena pořadím čtyř druhů chemických látek, tzv. bází. Tyto báze mají mj. schopnost se vzájemně definovaně párovat a tvořit známou dvojitou šroubovici. Na principu párování je založena většina biologických pochodů s nukleovými kyselinami, zejména kopírování genetické informace, tzv. překlad genetické informace do struktury bílkovin a regulace aktivity jednotlivých genů. |
|
Protilátky (imunoglobuliny)
Bílkoviny produkované bílými krvinkami savců jako obrana proti cizím biologickým objektům (antigenům), např. virům, mikroorganismům nebo bílkovinným jedům. Organismus je schopen produkovat ohromné množství nejrůznějších protilátek schopných velmi pevné vazby na konkrétní antigen. Vazba mnoha protilátek zabrání vetřelci v poškození organismu a zároveň ho označí jako objekt k likvidaci. |
|
Živočišné tkáně a rostlinná pletiva
Představují sadu buněk s ohraničenou funkcí. Nepatří mezi nejpoužívanější biologický materiál, zejména pro obtížnou manipulaci. Kultivace mimo rodičovský organismus bývá dosti nesnadná a také drahá. Izolované tkáně vyžadují velmi přesné dodržování životních podmínek, jinak hynou. Výhodou použití tkání je jejich biologická odpověď podobná živému organismu. |
V konstrukci biosenzorů se v poslední době uplatňují nové metody umožňující miniaturizaci a také přesnější provedení. Jde např. o nanášení materiálu tryskami (obdoba inkoustové tiskárny); to dovoluje realizovat na požadované matrici přesné geometrické obrazce. Mikro- a nanotechnologie umožňují i další věci, např. nanášet tenké vrstvy, vytvářet v matrici mikroskopické kanálky a nádržky nebo do senzoru zabudovat miniaturní stroje, např. mikropumpy.
4. Enzymové biosenzory
Enzymy jsou biologický materiál, který se při konstrukci biosenzorů používá nejčastěji. Jejich hlavní výhodou je jednoduchost a s ní spojená dobrá definovatelnost odpovědi. Enzymaticky katalyzované reakce jsou rychlé, obvykle velice selektivní a nejčastěji se řídí kinetikou podle Michaelise a Mentenové. Z té mj. vyplývá, že při dostatečném množství enzymu je rychlost reakce v určitém rozsahu přímo úměrná koncentraci analytu. Je tudíž možné konstruovat kalibrační křivky a kvantitativně stanovovat obsah analytu.
Enzymy používané ve větším měřítku už obvykle nejsou izolovány z původních organismů, ale je snaha je produkovat levněji a ve větším množství vhodnými produkčními mikroorganismy. Tato operace vyžaduje izolaci genů příslušného enzymu a jejich vložení do genetické výbavy produkčního mikroorganismu. Tyto molekulárně-biologické techniky se dnes stávají téměř rutinní záležitostí. Manipulace na úrovni genů navíc umožňuje daný enzym modifikovat a získat tak vylepšený enzym, např. s vetší teplotní stabilitou.
5. Mikrobiální biosenzory
Z hlediska konstrukce biosenzorů patří mezi nejperspektivnější biologický materiál mikroorganismy. Každá buňka představuje nezávislého jedince, a je proto obvykle odolnější a trvanlivější jak v porovnání s buněčnými částmi, tak v porovnání s tkáněmi a pletivy vyšších organismů. V porovnání s enzymy je jednodušší a levnější také kultivace a izolace mikrobiálních buněk. Nevýhodou celých buněk je naopak horší definovatelnost odpovědi. Mikrobiální buňka, ač relativně primitivní v porovnání např. s lidskou, je stále velmi komplexní objekt a na její fyziologii má vliv mnoho faktorů.
Mikroorganismy mívají oproti enzymům širší záběr látek, které vyvolají jejich odezvu. Důvodem jsou konvergentní metabolické dráhy. Proto nacházejí uplatnění zejména při monitorování znečištění životního prostředí. Mikroorganismy (zejména luminiscenční) je možné využít také pro detekci toxicity, přičemž se měří pokles jejich aktivity. Takový senzor je ale jen na jedno použití.
V budoucích celobuněčných biosenzorech pravděpodobně budou využívány geneticky modifikované mikroorganismy. Mezi nejperspektivnější patří tzv. bioreportéry (bioreporters). Jejich konstrukce využívá přirozené schopnosti některých mikroorganismů „zapínat„ a „vypínat„ některé své geny na základě fyziologických podmínek (např. v přítomnosti určité zkonzumovatelné látky). Genetickou modifikací je možné tyto geny nahradit nebo doplnit jinými geny, jejichž činnost se snadno měří. Používají se zejména geny pro bioluminiscenci, některé enzymy nebo tzv. Green Fluorescent Protein (GFP).
Použití geneticky modifikovaných organismů v EU ale zatím přísně regulují zákony (použití mimo uzavřenou laboratoř je nepřípustné). I proto je výzkum bioreportérů stále spíše v laboratorním stadiu. V USA, kde je legislativa volnější, jsou už ale popsána i první „terénní„ použití (např. sledování mikrobiální dekontaminace půdy znečištěné ropnými látkami).
6. Senzory s DNA
Senzory založené na DNA se rozšířily teprve v posledních několika letech ve spojitosti s pokroky molekulární biologie. Jako biologický materiál je DNA možné zvolit k identifikaci některých látek (např. některých mutagenů), nejčastěji se ale využívají pro identifikaci jiné DNA nebo RNA. Používají se např. tzv. próby, na nichž je imobilizována jednovláknová DNA o určité sekvenci. Jestliže se tato próba setká s DNA, která má tzv. komplementární sekvenci, spárují se spolu (tzv. hybridizace) a hledaná DNA zůstane na próbě navázána (viz rámeček Biologický materiál). Vznik dvouřetězcové DNA (a tudíž nalezení komplementární sekvence) je pak možné identifikovat např. fluorometricky.
|
Signály biologického materiálu a detektory |
|
Ampérometrické biosenzory
Využívají měření elektrického proudu po vložení napětí mezi dvě elektrody. Intenzita elektrického proudu by měla být závislá na probíhající reakci katalyzované opět enzymem. |
|
Biosenzory s povrchovou plazmovou rezonancí
Jsou založeny na opticko-elektrickém jevu, který vzniká na rozhraní kov-dielektrikum při totálním odrazu světla na tomto rozhraní. Při určitém úhlu světla dojde k maximálnímu přenesení energie světla na elektrony atomů kovu v povrchové vrstvě (tzv. plazmony), což se navenek projeví poklesem intenzity odraženého světla. Modifikace kovové vrstvy např. pomocí komplexu protilátka-antigen vede k posunu rezonančního maxima. Tento posun je měřen interferencí s kontrolním světlem. |
|
Elektrochemické biosenzory
Patří mezi nejdéle používané a mohou využít nejrůznější změny elektrochemických parametrů. Potenciometrické biosenzory využívají iontově selektivní elektrody v kombinaci s imobilizovaným enzymem. Ionty vznikající při reakci generují elektrický potenciál (napětí) měřitelný voltmetrem proti standardní elektrodě. |
|
Kalometrické biosenzory
Využívají měření změn teploty při biochemické reakci. Vyžadují velmi přesná čidla nárůstu teploty a v praxi se příliš nepoužívají. |
|
Konduktometrické biosenzory
Využívají změnu vodivosti (odporu) vzorku vyvolanou biochemickou reakcí. |
|
Optické biosenzory
Využívají měření světla nebo změny optických vlastností biomateriálu. Nejjednodušší optickou změnou je změna barvy, která se zaznamená buď pohledem, nebo je možné exaktněji měřit absorpci světla při určité vlnové délce spektrofotometrem. Jiné biosenzory jsou založeny na měření změn fluorescence fluorescenčními spektrofotometry. V přírodě jsou známy také luminiscenční organismy, které samy svítí viditelným světlem a jejich luminiscenční enzymy je možné využít v konstrukci luminiscenčních biosenzorů. Pro detekci je třeba dostatečně citlivý luminometr. Ke konstrukci biosenzorů lze také využít optická vlákna. Nanesená vrstva biologického materiálu může buď sama produkovat světelné signály nebo tyto signály měnit, např. změnou indexu lomu. |
|
Piezoelektrické biosenzory
Využívají vibrace v elektrickém poli měnící se mj. s tloušťkou krystalu. Obecně jsou velice citlivé na vnější podmínky (např. vlhkost ve vzduchu), jejich výhodou je naopak nízká cena a rychlá odezva. |
Uvedená technika v poslední době doznala robustnosti díky tzv. DNA-čipům. Za DNA-čip je označován malý kousek křemíkové matrice, na němž jsou v pravidelné mřížce imobilizovány všechny možné sekvence DNA o určité délce. Vzorek je pak hybridizován s touto sadou, přičemž dojde k tím pevnější vazbě vzorku na čip, čím podobnější je sekvence vzorku příslušnému místu čipu. Čip je poté fluorescenčně vyfotografován, přičemž intenzita světla odpovídá podobnosti struktury vzorku a příslušného místa čipu. Analýzou snímku je možné určit přímo sekvenci vzorku.
7. Imunosenzory
Předpokládá se, že savčí buňky jsou schopny produkovat protilátky proti téměř libovolné chemické struktuře. Toho se využívá při konstrukci biosenzorů s velmi velkou selektivitou, které umožňují identifikovat i stopová množství látky. Pro konstrukci biosenzorů se obvykle používají modifikované protilátky, např. s přivěšenou fluorescenční nebo enzymovou značkou.
Imunochemické stanovení může mít různé uspořádání. Z důvodu skutečně pevných vazeb protilátky s antigenem jsou mnohé imunosenzory často určeny pouze na jedno použití. Jiné techniky zase vyžadují ke stanovení vymývací krok. To je i případ asi nejrozšířenější imunochemické metody ELISA (Enzym-Linked Imunoassay), která je založena na vzájemném soutěžení volné a imobilizované protilátky o analyt a umožňuje kvantitativní stanovení přítomnosti analytu. Velice perspektivní se jeví identifikace komplexu protilátka-analyt prostřednictvím povrchové plazmové rezonance (viz rámeček Signály biologického materiálu a detektory), která dovoluje velice citlivé a rychlé stanovení přítomnosti analytu.
Již zmíněné metody jsou zaměřeny na identifikaci konkrétní látky (např. hormonu nebo určité bílkoviny krevní plazmy). Je však také možné zkonstruovat pole, na kterém bude imobilizováno množství protilátek a které umožní i kvalitativní analýzu. Podobné konstrukce jsou ale zatím dost nákladné zejména pro vysoké ceny protilátek.
|
Imobilizace biologického materiálu |
|
Imobilizace
Imobilizace (znehybnění) biologického materiálu je nedílnou součástí konstrukce biosenzoru. Imobilizace umožňuje upevnit biologický materiál k ostatním částem senzoru, zejména k detektoru, zabraňuje unikání materiálu do prostředí a umožňuje opakované použití senzoru. Imobilizace má i funkci ochrannou, např. zvětšuje tepelnou stabilitu materiálu nebo zabraňuje jeho kontaminaci zvnějšku. Vhodná matrice také účinně brání dělení mikrobiálních buněk. |
|
Imobilizace bez matrice
Biologický materiál (zejména bílkoviny) je možné imobilizovat vzájemným prokřížením molekul, čímž vznikne pevný materiál. Pro tento účel se používá např. glutaraldehyd. |
|
Imobilizace bez vazby
Využívá obklopení materiálu pevnou matricí. Takováto matrice je obvykle připravována z tekutých surovin, které v průběhu procesu výroby senzoru zatuhnou. Do této oblasti patří tzv. biocers (biologically modified ceramics – biologicky modifikovaná keramika), tedy pevné keramické materiály s imobilizovaným biologickým materiálem, v poslední době velmi populární. Jejich výhodou jsou dobré optické vlastnosti. |
|
Imobilizace kovalentním připojením
Používá se pro připojení biologického materiálu na povrch nosiče. Kovalentní vazby jsou pevné, nicméně hrozí, že toto spojení sníží aktivitu biologického materiálu. Pro připojení je nutné nosič vhodným způsobem aktivovat, aby byl umožněn vznik vazeb. |
|
Imobilizace nekovalentním spojením
Nekovalentní vazby (iontové vazby, vodíkové můstky, hydrofobní interakce) jsou slabší než kovalentní vazby, nicméně současné působení většího množství slabých vazeb může kovalentní vazbu i předčit. Výhodou nekovalentních vazeb je jejich vratnost, změna podmínek (např. změna hodnoty pH) může vyvolat změnu pevnosti vazby, a tak je možné materiál z matrice uvolnit. |
Rozvoj imunotechnik je možný rovněž díky rozvoji metod pro produkci protilátek ve velkém. Dřívější získávání protilátek přímo z krevního séra imunizovaných zvířat je nahrazováno genetickými manipulacemi produkčních bakterií, konjugacemi nádorových buněk s bílými krvinkami a podobnými postupy. I tak jsou ale protilátky stále poměrně drahé.
8. Použití biosenzorů v praxi
Aby se biosenzor uplatnil v praxi, měl by splňovat alespoň některá z těchto kritérií:
dostatečná selektivita pro účely dané analýzy,
dostatečná stabilita v průběhu analýzy,
opakovatené použití (i když svá uplatnění mají i senzory na jedno použití),
reakce probíhající v biosenzoru by měla být nezávislá na fyzikálních parametrech, jako jsou pH, teplota, míchání apod., což umožňuje provádět analýzy bez předchozí úpravy vzorku,
odpověď senzoru by měla být správná, přesná, reprodukovatelná a lineární v co nejširším rozsahu koncentrací, aby nebylo nutné např. vzorek ředit; užitečný signál ze senzoru by také měl mít dostatečný odstup od šumu,
biosenzor použitelný v medicíně pro měření v živých orgánech musí být biokompatibilní (nesmí být jedovatý, nesmí způsobovat alergické reakce apod.),
biosenzor použitelný v biotechnologiích by měl být sterilizovatený (např. v autoklávu),
biosenzor by měl být levný, pokud možno malý a přenosný a snadno použitelný; s jeho použitím by si měla poradit i méně odborně zdatná obsluha,
hotový biosenzor by měl mít uplatnění na trhu.
Je třeba konstatovat, že mnoho biosenzorů větší část z uvedených kritérií nesplňuje.
V dnešní době nacházejí biosenzory uplatnění zejména ve čtyřech oblastech: v medicíně, při ochraně životního prostředí, při kontrole potravin a při biotechnologických procesech. Do jiných oborů biosenzory zatím výrazněji nepronikly.
V medicíně se biosenzory uplatňují zejména v klinické diagnostice např. při stanovování nejrůznějších složek krve, detekci metabolických produktů, identifikaci patogenních mikroorganismů apod. Příslušná zařízení bývají dosti drahá a vyžadují vyškolenou obsluhu, nicméně vyšší pořizovací náklady jsou vyváženy hromadným použitím v nemocnicích a nenahraditelnými poskytovanými informacemi. Levnější zařízení ale pronikají i k jednotlivým uživatelům (pacientům), např. už zmiňované glukometry patří k běžnému vybavení diabetiků. Do kategorie biosenzorů patří např. i masově využívané těhotenské testy, diagnostické papírky pro vyšetření moči apod.
V potravinářství se biosenzory využívají zejména při stanovování kvality potravin. Pomocí biosenzorů je možné stanovovat jak základní složky potravin (např. sacharidy, tuky apod.), tak speciální látky (např. vitaminy). Velký význam mají biosenzory při detekci nežádoucích kontaminací v potravinách, např. plísňových toxinů, patogenních mikroorganismů, rozkladných produktů apod.
Při ochraně životního prostředí jsou biosenzory využívány zejména k detekci znečištění. V tomto směru jsou vhodné zejména celobuněčné biosenzory, které citlivě reagují na určité skupiny látek (např. polyaromatické uhlovodíky). Kromě detekce znečištění jsou biosenzory používány při stanovování tzv. biologické spotřeby kyslíku a k monitorování půdní mikroflóry a metabolické aktivity půdních organismů. Použití biosenzorů je nejdál při sledování kvality vody, biosenzory ale pomalu pronikají i do oblasti sledování půdy a ovzduší.
V biotechnologiích nacházejí biosenzory uplatnění zejména při řízení procesů (měření koncentrace živin a produktů) a při kontrole jakosti produktů (např. identifikace nežádoucí kontaminace).
9. Budoucnost biosenzorů
Pokroky biologických i technických věd dávají tušit, že biosenzory budou využívány čím dál častěji. Ve vzdálenější budoucnosti to pravděpodobně budou zcela umělé enzymy „šité na míru„ konstruovaného biosenzoru. Úplné sci-fi pravděpodobně není ani umělý mikroorganismus, tedy spíše molekulární robot.
|
Příklad: Jak různými biosenzory stanovit obsah glukózy |
|
Analytem patrně nejčastěji stanovovaným biosenzory je glukóza. Tento vložený text uvádí některé možnosti její detekce, např. následujícími způsoby (všechny uvedené metody využívají enzym glukózaoxidázu, který katalyzuje tuto reakci: glukóza + kyslík à kyselina glukonová + peroxid vodíku): |
|
1. Clarkova elektroda. Princip stanovení využívá Clarkovu elektrodu, která ampérometricky měří koncentraci kyslíku ve vodném roztoku. Clark imobilizoval enzym glukózaoxidázu s použitím permeabilní membrány přímo na tuto elektrodu. Je-li v prostředí přítomna glukóza, dochází na místech s enzymem k její oxidaci, a tím k lokálnímu spotřebování kyslíku, který je měřen Clarkovou elektrodou. Při konstantní koncentraci enzymu závisí rychlost reakce na koncentraci glukózy. Díky tomu je možné sestrojit kalibrační křivku glukózy, a použít tak Clarkovu elektrodu pro kvantitativní stanovení obsahu glukózy. |
|
2. Potenciometrické stanovení. Uspořádání biosenzoru je podobné jako v předchozím případě (ad 1), jen namísto Clarkovy elektrody se použije skleněná pH elektroda, na kterou je imobilizován enzym. Využívá se to, že produkovaná glukonová kyselina ve vodném prostředí disociuje a uvolňuje vodíkové kationy. Tím dochází k lokálnímu nárůstu pH, který je opět měřen elektrodou. |
|
3. Fluorescenční stanovení. Senzor využívá vlastnosti tzv. rutheniového komplexu měnit své fluorescenční vlastnosti podle koncentrace kyslíku (větší koncentrace kyslíku vyvolá pokles poločasu zhášení fluorescence). Jsou-li rutheniový komplex a enzym imobilizovány blízko sebe, je opět možné fluorescenčně měřenou koncentraci kyslíku převést na koncentraci glukózy. |
|
4. Indikátorové papírky. Na papírek je imobilizován enzym glukózaoxidáza spolu s enzymem peroxidázou a vhodnou indikační látkou (např. o-toluidin). Využívá se produkovaný peroxid vodíku, který za katalýzy enzymem peroxidázou oxiduje indikační látku. Oxidací se látka zbarví a toto zbarvení je indikováno. |
|
K uvedenému přehledu metod je třeba poznamenat, že enzym glukózaoxidázu je možné nahradit jiným podobným enzymem a získat tak jiný biosenzor. Například pro stanovení ethanolu je možné použít v případech ad 1, 3 a 4 enzym alkoholoxidázu, který katalyzuje oxidaci ethanolu kyslíkem na acetaldehyd. Pro stanovení močoviny je možné v případě ad 2 použít enzym ureázu, který katalyzuje rozklad amoniaku na amonné ionty a oxid uhličitý. A podobných náhrad lze najít mnoho. |
Budoucnost patří miniaturizaci a nanotechnologiím. V medicíně se např. předpokládá použití nanosenzorů na biologickém základě pro trvalé sledování a regulaci metabolismu nemocných. Lze si představit např. nanorobota se zabudovaným biosenzorem pro měření hladiny glukózy v krvi, který bude u diabetiků regulovat vylučování inzulinu. Podobný nanorobot („nanotank„) by mohl např. léčit rakovinu. Pomocí zabudovaného imunosenzoru by rozpoznal rakovinnou buňku od zdravé a zničil ji.
Velký rozmach pravděpodobně zaznamenají senzory s DNA. Ty by měly umožnit např. rychlou detekci vrozených genetických poruch (částečně už nyní) nebo např. odhalit vznikající rakovinu v časném stadiu. Senzory s DNA by se také mohly stát standardem pro identifikaci osob. Místo nejrůznějších magnetických karet, čipů či přihlašovacích hesel by stačila např. jedna kožní buňka, získaná otiskem prstu. Z té by si senzor izoloval příslušný úsek DNA a oprávněnou osobu podle ní identifikoval.
A pokud na závěr popustíme uzdu fantazii, lze si představit leccos. Třeba konzervu informující o tom, zda je pokrm uvnitř ještě poživatelný.
Doporučená literatura:
[1] SKLÁDAL, P.: Biosensory. Masarykova univerzita, Brno, 1999.
[2] EGGINS, B.: Biosensors – An Introduction. Wiley Chichester, 1996.
[3] BUERK, D. G.: Biosensors, Theory and Applications. Technomic Lancaster, 1993.
[4] TURNER, A. P. F. – KARUBE, I. – WILSON, G. S.: Biosensors: Fundamentals and Applications. Oxford University Press, 1987.
S ohledem na skutečně přehledový charakter článku autor neuvádí všechny zdroje, ze kterých čerpal, ale namísto nich několik titulů vhodných pro uspokojení případného hlubšího zájmu o danou problematiku (v pořadí sestupně podle roku vydání).
Ing. Josef Trögl, Ph.D.,
Mikrobiologický ústav AV ČR
(troglj@email.cz)
Autor vystudoval obor obecná biochemie na VŠCHT Praha. Na téže škole obhájil v roce 2005 disertační práci zaměřenou na konstrukci optického biosenzoru pro monitorování životního prostředí. Nyní pracuje v sektoru ekologie v Mikrobiologickém ústavu AV ČR na studiu půdních společenstev bakterií a hub.
1) Uvedená definice biosenzoru je velmi obecná. Názvoslovná komise Mezinárodní společnosti pro čistou a užitou chemii (IUPAC) doporučuje rozlišovat tzv. pravé biosenzory, které fungují plně automaticky a umožňují kontinuální měření analytu, od bioanalytických systémů, které při použití vyžadují dodatečné operace (např. přídavek některých činidel), a od tzv. bioprób (angl. bioprobes), které jsou určeny jen na jedno použití. I přes toto doporučení jsou biosenzory stále chápány spíše šířeji a takto je pojímá i tento článek.
|